一、半抗原的設(shè)計與人工抗原的制備

如前所述，小分子化合物不能使動物機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。在免疫分析中，小分子化合物抗體的制備通常是將該化合物或化合物的特征部分與蛋白大分子結(jié)合，使之獲得免疫原性，然后刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體?？贵w可以特異性地與目標(biāo)化合物結(jié)合，發(fā)生免疫反應(yīng)。這種僅具有和相應(yīng)抗體結(jié)合的免疫反應(yīng)性，而沒有免疫原性的物質(zhì)叫做半抗原。與半抗原結(jié)合，并使其獲得免疫原性的蛋白質(zhì)叫做載體。載體與半抗原的復(fù)合物叫做人工抗原或*抗原。半抗原通常通過一個雙功能化合物(即分子兩端都具有活性功能團(tuán)的化合物)結(jié)合在載體蛋白上，這段化合物稱為連接臂或間隔臂。半抗原的設(shè)計和合成是影響抗體的選擇性和特異性的關(guān)鍵步驟，也是一個免疫親和萃取方法能否成功建立的關(guān)鍵。一般而言，在半抗原和人工抗原的設(shè)計和制備過程中應(yīng)綜合考慮以下幾個主要因素:

①半抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)在大小、幾何形狀、化學(xué)組成、電荷分布等條件應(yīng)盡量與目標(biāo)化合物類似，尤其是要保留日標(biāo)化合物的特征分子部分。很多情況下，以化合物的特征分子部分作為半抗原的主體，免疫動物制備的抗體對目標(biāo)化合物都具有較好的特異性和選擇性。

②避免用對免疫反應(yīng)有重要作用的功能基團(tuán)(如-NH₂，-NO₃等)與連接臂結(jié)合。因為與連接臂分子結(jié)合后，這些基團(tuán)的化學(xué)特性將可能發(fā)生很大變化，從而可能對生物體的免疫響應(yīng)產(chǎn)生“誤導(dǎo)”，使機(jī)體產(chǎn)生的抗體不能很好地識別目標(biāo)化合物。

③由于抗體的特異性和選擇性與半抗原上的分子在免疫系統(tǒng)中的暴露狀況有關(guān)，因此，連接臂與半抗原的結(jié)合位點應(yīng)盡量遠(yuǎn)離半抗原分子的特征位點。

④盡量避免在連接臂上出現(xiàn)雜原子(如N、S、P等)和吸電子基團(tuán)，因為這些基團(tuán)可能影響半抗原的電子分布，使半抗原與目標(biāo)分子的相似性降低，影響免疫效果。常用的間隔臂一般由一個或幾個亞甲基基團(tuán)組成。

⑤間隔臂的長度應(yīng)適中。間隔臂的作用一方面是將小分子連接到載體蛋白上；另一方面是將小分子突出，使其免受載體蛋白屏蔽效應(yīng)的影響。間隔臂的長度以3～6個分子距離為宜，太長的間隔臂會因空間折疊而減弱目標(biāo)分子結(jié)構(gòu)在免疫系統(tǒng)中的暴露。但是，對分子尺寸比較大的半抗原，間隔臂的重要性降低。

與放射性標(biāo)記免疫分析(RIA)、酶聯(lián)免疫分析(ELISA)、免疫傳感器(Immunosensor)等免疫分析方法不同，免疫親和萃取對抗體的特異性要求可以相對較低，因為目前使用免疫親和萃取或免疫親和色譜的主要目的是將樣品基質(zhì)中難以用常規(guī)方法去除的于擾物，如腐殖酸等去除，而且可以將免疫親和柱的洗脫液送入色譜柱進(jìn)一步分離，所以在實際應(yīng)用中，具有“分類識別”(Class-se-lective)能力，即對某一類化合物具有親和能力的抗體可能更具有實用價值。“分類識別”抗體的制備可以通過在半抗原分子上有意識地突出此類化合物的特征分子結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)。

由于抗原與抗體的結(jié)合是通過非共價相互作用實現(xiàn)的，因此，可以利用計算機(jī)分子模型，通過分析半抗原分子與目標(biāo)抗原分子之間的相似性來指導(dǎo)半抗原的選擇與合成。通?？疾斓膮?shù)為分子的空間構(gòu)型、電子分布等。例如，對于目標(biāo)化合物2,4,6-二氯苯酚(2,4,6-TCP) ,可以在如圖8-3所示的四個位置(1～4)衍生化，制備半抗原，為進(jìn)一步優(yōu)化選擇與目標(biāo)化合物性質(zhì)相近的半抗原，利用半經(jīng)驗MNDO和PM3數(shù)學(xué)模型對這些化合物的空間構(gòu)型、總電荷、苯酚環(huán)各碳原子上的電荷分布等進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在1號位置衍生所制備半抗原與目標(biāo)化合物的上述性質(zhì)為接近。進(jìn)一步的ELISA實驗證明，利用該半抗原制備的抗體對2,4,6-TCP具有很高的特異性。

圖8-3 2,4,6-TCP半抗原的衍生化位置

二、多克隆抗體的制備

用抗原免疫動物后得到的動物血清(抗血清)，是由體內(nèi)分別針對抗原物質(zhì)上的多個抗原決定簇的多個B細(xì)胞克隆發(fā)生應(yīng)答后產(chǎn)生的，因此叫多克隆抗體。早用于免疫研究的抗體就是多克隆抗體。對同一抗原決定簇，動物也可產(chǎn)生不同族、亞族和不同親和性的抗體，即使同一抗原用同一劑量免疫，也可因動物的種類和采血時間的不同，使血清中抗體的組成各異。因此，常規(guī)免疫血清中的抗體是多種多樣的。

通過常規(guī)免疫制備多克隆抗體的基本方法是：用劑量約為0.5mg·kg^-1體重的抗原和等體積的佛氏*佐劑充分混合，形成穩(wěn)定的油包水膠體，再加入0.1～0.2mL滅活的劃痕卡介苗，使?jié)舛燃s為0.1～0.2 mg·mL^-1佐劑，混勻。免疫家兔，致敏。家兔一般選用年齡6個月左右，體重約3 kg的健康新西蘭大白兔，2～3只。此后，每間隔7～10d加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫時用佛氏不*佐劑與抗原等體積混合。一般加強(qiáng)免疫3次即可，但第3次加強(qiáng)免疫之前，應(yīng)取兔耳緣靜脈血做抗體效價測定，以確定加強(qiáng)免疫的次數(shù)。當(dāng)抗體的效價達(dá)到滿意的結(jié)果時，將家免麻醉，進(jìn)行頸動脈放血。一般每只家兔可收集兔血100～150mL。收集的血液室溫放置1～2h，然后在4℃冰箱中過夜，使血清析出。用滴管吸取上層血清，下層血清和血漿混合物在1500r離心10min，將血清和血漿分離。血清中加入NaN₃(NaN₃的終濃度為0.2‰)，分裝，-20℃保存。

在一些免疫分析(如ELISA、RIA)中，可直接用抗血清進(jìn)行分析。但在免疫親和萃取中，因為要對抗體進(jìn)行固定化，所以需要從抗血清中分離純化IgG。常用的純化方法主要有硫酸銨沉淀法、離子交換柱色譜法、蛋白質(zhì)A吸附法等，具體操作可參閱相關(guān)文獻(xiàn)。

文章來源：《環(huán)境樣品前處理技術(shù)》

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